二級生物安全柜柜內氣體通過內置離心風機的驅動，從室內吸入的空氣和柜內原有的空氣混合后經凈壓箱。30%的氣體經排風過濾器排出，70%的氣體經下降流過濾器送入安全柜操作區循環。
與一級生物安全柜相同，氣體是從外部進入到二級生物安全柜里邊，一般稱作進流。進流可以避免在微生物操作時產生的氣溶膠從安全柜的操作窗口疏散到實驗室里。與一級生物安全柜不同的地方是，只讓經HEPA過濾的(無菌的)空氣流過工作臺面。內置風機把空氣經前面的開口引入安全柜內并進入前面的進風格柵。所以未通過過濾器過濾的空氣不能直接進入工作區，所以二級生物安全柜能夠確保安全柜內部存放的樣品及儀器不被外部空氣污染。
生物安全柜的空氣由前新風口進入負壓風道與柜體內空氣充分混合后，由風機送入靜壓箱，經過濾器過濾后以垂直層流的狀態進入操作區，操作區左右及后部墻體均為負壓風道，使工作區與外部環境形成氣幕及箱體雙層隔離。
如何證明二級生物安全柜的穩定性良好呢？
通過實驗證實生物安全柜在一定壓力下不會翻倒、變形，在負重時工作表面不偏移，負載時不傾斜。
抗翻倒：滿足UL標準；
抗變形：靜態下，安全柜頂部后緣和一側分別受到110kg側力時，頂部前緣與一側向前移動距離不超過1.6mm；
工作面抗偏移：在工作表面中心25×25cm區域內均勻負載23kg測試物，移去后工作面不發生永j性偏斜；
抗傾斜：實驗物110kg在安全柜前緣負載，其后面底部離地不會超過1.6mm。
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